三合一双层微针贴片，用于超声激活抗菌治疗和伤口愈合中的免疫调节

致病性细菌感染对公共卫生构成严重威胁，特别是在慢性和急性伤口中，细菌的定植和生物膜的形成使得伤口愈合变得更加困难。基于活性氧（ROS）的疗法具有广谱抗菌活性和低耐药性的优势，现已成为一种治疗感染创面的非抗生素策略。然而，其临床应用仍受限于给药效率低、细菌靶向性差及治疗后炎症失控等问题。

为此，武汉大学药学院黎威教授团队设计了一种多功能双层微针贴片（LFT/S-MN），旨在有效灭菌并促进伤口愈合。该贴片将带正电荷的乳铁蛋白基纳米粒子（LFT NPs）与卟啉声敏剂（TAPPFe）结合，放置在可溶解的基底层中，同时在pH响应的针尖层中加载抗炎药物spermidine（SPD）。当微针插入感染组织后，释放的LFT NPs能够有效靶向并聚集负电荷细菌，在超声刺激下通过协同的化学动力和声动力疗法（CDT/SDT）生成大量的ROS。同时，伤口的酸性微环境触发了针尖层的逐步降解，从而实现SPD的控制释放，进行免疫调节。在铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染的小鼠伤口模型中，LFT/S-MN贴片显著减少了细菌负荷，抑制了炎症反应，促进了胶原蛋白沉积和新生血管形成，并加速了伤口闭合。

这项工作提出了一种有前景的非抗生素策略，通过协同的CDT/SDT和炎症调节实现伤口抗菌与组织再生。该微针贴片是利用摩方精密面投影微立体光刻（PμSL）技术（microArch® S240，精度：10 μm）3D打印加工模具后经PDMS翻模制备而成，相关研究成果以“Three-in-one bilayer microneedle patch for ultrasound-activated antibacterial therapy and immune modulation in wound healing"为题发表在期刊《Journal of Controlled Release》上。武汉大学药学院2023级博士研究生姜鹏为论文作者，黎威教授为论文通讯作者，武汉大学药学院为论文完成单位，以上研究工作得到了国家自然科学基金项目和武汉大学泰康生命医学中心PI经费的支持。

如图1所示，该贴片在可溶解基层中集成了与卟啉声敏剂（TAPPFe）偶联的带正电荷的乳铁蛋白纳米颗粒（LFT NP），以及负载抗炎剂亚精胺（SPD）的pH响应尖层。插入感染组织后，释放的 LFT NP 有效地靶向并聚集带负电荷的细菌，从而在超声刺激下通过协同化学动力学和声动力学疗法（CDT/SDT）产生强大的 ROS。同时，酸性伤口微环境触发尖层的逐渐降解，可控的SPD 释放以进行免疫调节。在铜绿假单胞菌感染的小鼠伤口模型中，LFT/S-MN 贴片显着降低了细菌载量，抑制了炎症，促进了胶原蛋白沉积和新生血管形成，并加速了伤口闭合。

图1. LFT/S-MN贴片治疗感染伤口的结构和治疗机制示意图。（A）双层LFT/S-MN贴片的设计和制备是由负载正电荷LFT NPs的可溶基底层和封装SPD的pH响应尖层组成。（B）插入感染创面后，基底层迅速溶解释放LFT NPs， LFT NPs积极靶向带负电荷的细菌，并通过协同SDT和CDT在US下产生ROS，实现有效的细菌除去。同时，酸性伤口微环境触发尖层降解，导致SPD持续释放，用于炎症调节。这种联合策略促进细菌清除、免疫调节和组织再生，最终加速伤口愈合。

为了实现位点特异性和控制药物释放，使用顺序成型策略制备了pH响应双层MN贴片，称为LFT/S-MN贴片。为了可视化和结构验证，两个荧光探针，罗丹明B标记的牛血清白蛋白（RhB-BSA）和异硫氰酸荧光素（FITC），分别装载到纳米颗粒的尖和基底层（图2A和B）。尖层是通过紫外诱导自由基聚合和甲基丙烯酸壳聚糖（CSMA）与SPDTA之间的席夫碱交联合成的，基底层由18 wt%的聚乙烯醇（PVA）和蔗糖溶液组成，背衬层由20 wt%的聚苯乙烯（PS）组成。能量色散X射线能谱（EDS）分析（图2C）表明，来自LFT NPs的铁元素分布均匀，局限于基底层，而尖层的碳元素分布均匀，表明明显的空间分离。得到的LFT/S-MN贴片由一个10 × 10 MN阵列组成，跨度约0.5 cm2（图2D）。每根针都具有明确的圆锥形形态，高度约850 μm，具有明显的双层结构（图2E和F）。力学测试显示，每根针的断裂力约为4N（图2G），足以实现有效的经皮插入和潜在的临床应用。

图2. LFT/S-MN贴片的表征。（A-B）LFT/S-MN贴片的代表性明场和荧光图像，说明了掺入成分的结构完整性和荧光标记。（C）能谱图证实了MNs内元素的分布。（D）光学图像和（E, F）SEM图像显示LFT/S-MNs的形貌。黄色虚线表示ph响应尖层和可溶解基层之间的界面。（G）LFT/S-MNs的力-位移曲线，表明其机械强度适合皮肤穿透。

采用离体猪皮评价LFT/S-MN贴片的皮肤穿透能力。应用后，MNs成功突破角质层，并将封装的荧光染料输送到皮肤中，荧光成像显示（图3A），组织学横截面证实（图3B）。通过荧光显微镜观察LFT NPs的溶出行为和随后的释放。如图3C所示，基层在80秒内溶解在PBS（pH 7.4）中，促进LFT NPs从MN基中快速释放。考虑到感染的伤口微环境通常是酸性的，作者进一步研究了MN尖的pH响应行为。体外释放研究表明，尖层在轻度酸性条件下（pH 5.6）逐渐降解，到第15天几乎分解，而在中性条件下（pH 7.4）发生最小降解（图3D），表明尖层的酸敏感行为。定量测定药物装载和递送效率（图3E和F）。LFT为145.43 ± 2.76 μg，SPD为14.96 ± 0.08 μg。经皮肤给药后，LFT经MNs给药量为132.83 ± 2.91 μg，SPD经MNs给药量为14.38 ± 0.22 μg，两种药物的给药效率均超过90%。此外，SPD在酸性条件（pH 5.6）下的累积释放量在第15天达到88.87 ± 3.58%，显著高于PBS（pH 7.4），进一步证实了MN尖的酸响应释放谱（图3G）。

图3. LFT/S-MN贴片的药物释放评价。（A）LFT/S-MN贴片植入后猪离体皮肤的代表性亮场和荧光显微镜图像。（B）MN贴片植入后的猪皮肤组织学切片。（C）光学图像显示了80秒内PBS中基底层的快速溶解和尖层的分离。（D）倒置荧光显微镜图像显示在不同pH条件下（pH 7.4和5.6），模拟中性和轻度酸性伤口环境下，MN在15天内降解。（E） LFT/S-MN贴片LFT装载和递送的量化。（F） LFT/S-MN贴片SPD装载和递送的量化。（G） LFT/S-MNs中SPD随时间的体外累积释放曲线。数据以mean ± SD表示（n = 3个独立样本）。

作者系统评价了LFT/S-MN贴片的体外抗菌效果。如图4D所示，超声照射（3 MHz, 0.97 W/cm2，50%占空比，30 min）下LFT的最小抑制浓度（MIC）为128 μg/mL。单独的LFT/S-MN贴片表现出中等的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌的抑制率为36.41 ± 0.75%，对铜绿假单胞菌的抑制率为35.87 ± 1.48%（图4A和E）。相比之下，超声波激活后，LFT/S-MN贴片的抑菌率显著提高，分别为99.95 ± 0.04%和99.96 ± 0.04%（图4E），表明细菌几乎失活。SYTO 9/PI染色进一步验证了这些结果，其中LFT/S-MN US组显示出主要的红色荧光，表明广泛的细菌死亡（图4B和F）。扫描电镜（SEM）提供了额外的形态学证据；未处理组的细菌保持了完整和光滑的膜，而暴露于超声激活的LFT/S-MN的细菌则表现出明显的结构破坏和膜破裂（图4C）。总的来说，这些发现证实，超声激活后，LFT/S-MN贴片可以产生大量的局部ROS，从而在病变部位有效地消灭细菌。

图4. LFT/S-MN贴片体外抗菌性能研究。（A）琼脂板的代表性照片，显示LFT/S-MNs对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抗菌效果。（B）荧光显微镜图像显示金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在不同处理条件下产生ROS引起的氧化应激。（C）处理后细菌形态的SEM图像，显示金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的膜破坏和结构变形。（D）LFT在LFT/S-MNs中对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度（MIC），显示出剂量依赖性的抗菌活性。红色箭头表示LFT的MIC值。（E）不同处理后细菌活力的定量分析，通过活/死染色评估。（F）活/死实验中相应的绿色荧光强度（FI）测量结果，进一步证实了抗菌作用。数据显示以mean ± SD（n = 3个独立样本）。** p < 0.01，** p < 0.001，**** p < 0.0001。ns表示无显著性。

为了验证LFT/S-MN贴片的体内治疗效果，作者利用铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）建立小鼠皮肤创面感染模型（图5A）。将感染小鼠随机分为8组（每组n = 5），包括非超声组（Blank、S-MN、LF/S-MN、LFT/S-MN）和超声处理组（Blank+US、S-MN+US、LF/S-MN+US、LFT/S-MN+US）。超声方案包括3 MHz每日照射，0.97 W/cm2，50%占空比，30分钟，连续3天。在治疗后第0、1、3、5和9天通过拍照监测伤口进展（图5B）。第1天，LFT/S-MN+US组脓性渗出明显减少，反映了CDT和SDT的联合抗菌作用。相比之下，非超声组表现出更广泛的脓毒和炎症。第3天，超声给药完成后，收集伤口床样本进行细菌培养，评估残余细菌负荷（图5E）。平板计数显示，LFT/S-MN+US组菌落形成最少，表明其体内抗菌活性更强（图5F）。到第9天，LFT/S-MN+US处理的小鼠伤口愈合率很高，组织再生明显（图5C）。在整个治疗过程中，体重监测显示各组之间没有明显的波动（图5D），表明MN贴片具有良好的全身生物相容性。综上所述，这些结果表明，LFT/S-MN与超声结合，可以有效地消除细菌感染并显著加速体内伤口愈合。

图5. LFT/S-MN贴剂的体内抗菌效果和伤口愈合性能。（A）铜绿假单胞菌感染小鼠伤口模型的示意图和使用MN贴片加或不加US刺激的治疗策略。（B）处理后第0、1、3、5和9天伤口部位的代表性照片。黑色虚线圈表示初始伤口边界。（C）各治疗组伤口愈合随时间的定量分析（n = 5）。（D）治疗期间小鼠体重监测（n = 5）。（E）各组第3天伤口床培养细菌菌落的琼脂板照片。（F）基于菌落形成单位（CFU）分析的细菌活力量化（n = 3）。数据以mean ± SD表示。*** p < 0.001，**** p < 0.0001。ns表示无显著性。

结论：此研究成功开发了一种pH响应的双层微针贴片（LFT/S-MN），通过整合超声激活的协同抗菌疗法（CDT/SDT）与酸性微环境触发的免疫调节，实现了对感染伤口的高效治疗。该贴片不仅能快速释放靶向细菌的LFT NPs，在超声下产生大量ROS以清除细菌和生物膜，还能在伤口酸性条件下持续释放SPD，调节巨噬细胞极化，抑制过度炎症。体内实验证实，该策略能显著加速伤口闭合，促进组织再生，且具有优异的生物安全性。该工作为非抗生素依赖的感染伤口治疗与组织再生提供了一种具有临床转化潜力的新策略。