IF29.1！微针再发顶刊！安徽医科大学最新AM

光动力治疗（PDT）凭借活性氧（ROS）的强氧化能力在细菌感染和肿瘤治疗中应用广泛，但ROS也是在高效杀菌/杀瘤的同时，往往会加剧局部炎症反应、激活HIF-1α与NF-κB通路，甚至促进肿瘤转移。在痤疮PDT中患者常出现瘙痒、红斑、色素沉着等副作用；在黑色素瘤治疗中，ROS过量还会增加90%肿瘤相关死亡背后的转移风险。因此，如何在PDT后及时、精准、可控地清除多余ROS和炎症因子成为关键科学问题。

近期，安徽医科大学钱海生、王婉妮、徐令令团队制备了血红蛋白（Hb）偶联的二氢卟酚e6（Ce 6）光敏剂纳米粒（HPC NPs）和原花青素抗氧化剂纳米粒（PCN NPs），并利用微模法将其组装到棋盘结构的MN贴片（HPC@PCN CMN）中，实现HPC和PCN纳米粒的有序空间分离和程序化时间释放，实现先PDT、后抗炎的程序化时序释药（图1）。

相关研究成果以“Chessboard Microneedle Array for Inflammation Regulation via Spatiotemporally Controlled Drug Delivery"为题发表在《Advanced Materials》上。

• 棋盘式微针的精巧设计

作者首先制备了两种功能性纳米颗粒：HPC NPs——通过EDC/NHS偶联将光敏剂二氢卟吩e6（Ce6）耦联到血红蛋白（Hb）上、进一步接枝聚赖氨酸（PL）以获得正电性zeta电位（图2a-b），便于吸附到带负电的痤疮丙酸杆菌表面，并在660 nm激光下高效产生单线态氧；PCN NPs——以原花青素与茶碱自组装形成的抗氧化纳米颗粒（图2c），在10 μg/mL浓度下SOD活性消耗率达近50%、对ABTS·⁺实现清除（图2d）。随后，HPC NPs被混入未交联的透明质酸钠（SH）、PCN NPs被混入BDDE交联的SH，通过模塑法制成交错排列的棋盘式微针贴片（HPC@PCN CMN，图1A-C），该微针贴片模具是由摩方精密面投影微立体光刻（PμSL）技术（nanoArch^® S130，精度：2 μm）制备而成。SEM显示针体呈整齐的尖刺阵列（图2e-f），FITC/Cy5.5标记的荧光图像清晰呈现深绿HPC与红棕PCN的棋盘式分布（图2g）。体外溶解实验显示，未交联HPC针尖在PBS中10秒内几乎溶解，而交联PCN针尖仅缓慢溶胀；通过调节交联度可程序化调控缓释速率（图2h-i），COMSOL模拟与实测释放曲线一致：HPC NPs在5 min内释放，PCN NPs在24 h内累计释放约90%（图2j-l）。

图2. NP和HPC@PCN CMN的表征和性质。

• PDT与抗炎的时序协同

体外细胞与抗菌实验验证了HPC@PCN CMN的时序协同效果。HPC NPs在避光条件下对RAW264.7、L929、HUVEC三种细胞均保持良好生物相容性（图3a-b），但在660 nm激光辐照下，仅2.5 μg/mL即可将B16F10细胞活力降至对照的20%（图3c）。单线态氧探针定量表明HPC NPs浓度依赖性产生单线态氧、4倍浓度的PCN NPs可将其清除（图2m）。P. acnes抗菌实验得到一致结论：HPC MN(+)与HPC@PCN CMN(+)组菌落几乎清除、活/死染色显示大量死菌、扫描电镜下细菌表面塌陷破裂、生物膜被显著破坏，而CSMN(+)组因药物拮抗导致效果大幅下降（图3f-i）。上述实验证明棋盘式结构在保证PDT疗效的同时，为后续抗炎创造了有利条件。

图3. HPC@PCN CMN的体外抗肿瘤和抗菌作用。

• 抗炎机制
  

RNA-seq与DIA蛋白质组学揭示了HPC@PCN CMN抗炎的分子机制。HPC MN(+)组中炎症相关RNA（IL-1α、IL-1β、IL-6、MMP12）和线粒体ATP合成相关RNA（NDUFA2、mt-atp6、mt-Nd2等）显著上调，GO富集分析指向NIK/NF-κB信号与线粒体ATP合成通路（图4a-c）。蛋白组学进一步显示，HPC MN(+)组中ATP合酶相关蛋白（Atp5pb、Dmac2l、NDUFA1/2、DLAT等）和炎症蛋白（Ccl5、Tlr3、IL-1β、MMP12/14）显著升高，其中P2RX4（ATP激活的P2X受体家族）的表达上升引人关注——意味着HPC引发的ROS可能通过促进线粒体ATP合成、ATP外泄，进而激活P2RX4离子通道，引发钙离子内流、ASC寡聚化、caspase-1激活、IL-1β成熟与释放的炎症级联（图5a-e，图6a-f）。流式细胞术与qPCR显示HPC MN(+)组M1型巨噬细胞比例约35%、炎症因子mRNA显著上调；加入P2RX4抑制剂5-BDBD后上述指标均明显回落，验证了ATP-P2RX4通路的关键介导作用（图6g-i）。相比之下，HPC@PCN CMN(+)组通过PCN NPs的缓慢释放在PDT后阶段及时清除过量ROS、抑制P2RX4表达，M1型巨噬细胞比例降至约15%、炎症因子表达回落（图4d-f）。

图4. HPC@PCN CMN的体外抗肿瘤和抗菌作用。

图5. 不同处理组BMDM的蛋白质组学分析。

图6. HPC@PCN CMN抗炎机制的研究免疫荧光图像。

• 痤疮与黑色素瘤的双重验证

最后，体内实验进一步证实了HPC@PCN CMN的疗效。在小鼠痤疮模型中，治疗10天后对照组（G1-G4）痤疮体积仍约100 mm³，而HPC MN(+)（G5）和HPC@PCN CMN(+)（G6）组痤疮近乎消失（图7a-c），细菌培养与H&E、Masson、DHE、IL-1β染色显示G6组细菌量显著降低、胶原沉积显著增加、ROS与IL-1β水平显著下降（图7e-h）。免疫荧光与流式分析进一步揭示G6组CD86表达下调、CD206表达上调、M1/M2比值显著逆转（图8a-h）。

图7. HPC@PCN CMN的体内抗菌研究。

图8. HPC@PCN CMN的体内抗炎研究。

在小鼠黑色素瘤模型中，治疗7天后G5/G6组肿瘤体积仅约100 mm³（约为对照的1/5）、肿瘤重量约为对照的1/4（图9a-f），且G6组肿瘤组织中ROS、IL-1β水平和TGF-β、vimentin、E-cadherin等转移相关蛋白表达均显著降低，DHE染色显示PCN NPs有效清除了PDT引发的过量ROS（图9g-h）。

总结：本文以棋盘式空间分离和交联度调节时序释放的微针设计语言，把PDT巧妙化解为先杀菌/杀瘤、再清除炎症的可控治疗流程；机制层面进一步揭示了PDT通过ATP-P2RX4通路激活NLRP3炎症小体的新机制，并为抗氧化剂程序化介入提供了清晰的干预节点。该体系采用微模塑工艺、模具可重复使用数千次、所用SH与已上市药物兼容性良好，具备良好的临床转化基础，有望在痤疮、皮肤感染乃至浅表肿瘤的精准局部治疗中获得更广泛的应用。